前列腺癌中基质金属蛋白酶7,9的表达及其与VE
前列腺癌中基质金属蛋白酶7,9的表达及其与VEGF的关系
作者:周洪澜 邢春伟 葛岩 王心蕊 王医术
【摘要】 目的 探讨基质金属蛋白酶7,9在前列腺癌转移侵袭中的作用,以及VEGF与基质金属蛋白酶的关系。方法 采用免疫组织化学和形态定量分析方法分析MMP7及MMP9表达情况,同时培养PC3M细胞并采用Boyden小室侵袭试验及酶谱分析观察MMP9及其与VEGF在前列腺癌中的作用。结果 前列腺癌各分级中MMP7和MMP9的表达均有显著性差异(P<0?001)。boyden小室侵袭实验显示,不同试验组穿透matrigel的细胞数依次递减,即pc3m> PC3M+MMP9Ab (1∶100)> PC3M+MMP9Ab (1∶50),均有显坐的统计学差异(P<0?01)。酶谱分析观察发现,直接培养于培养皿表面的pc3m 细胞仅有稳定的mmp?9和mmp?2酶原表达,但pc3m细胞与vegf共孵育组条件培养基中mmp?9酶原含量以vegf剂量依赖的方式增加。结论 mmp7和mmp9可作为肿瘤侵袭和转移的判定指标。vegf与mmps的分泌有关,其机制有待于进一步探讨。<>
【关键词】 前列腺癌;基质金属蛋白酶;血管内皮细胞生长因子
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)生物学效应贯穿于肿瘤发展的各个环节〔1,2〕。血管内皮生长因子(VEGF)作为一种与肿瘤发生、发展密切相关的生长因子,可通过细胞内信号转导的级联放大效应而调节MMPs的产生与活化〔3,4〕,使得细胞外基质(ECM)处于不断地合成与分解代谢的动态平衡中,这种动态平衡的稳定是维持组织细胞结构和功能的重要基础。本研究以前列腺癌作为研究对象,探讨前列腺癌中金属蛋白酶与肿瘤转移侵袭的关系,以及金属蛋白酶和VEGF的关系。
1 材料与方法
1?1 材料
所有前列腺癌材料取自手术切除的新鲜组织,共计34例,其中5例Gleason Grade 2,9例Gleason Grade 3,14例Gleason Grade 4,6例Gleason Grade5。5例正常前列腺组织取自意外死亡的正常男性青年。所有标本均经严格筛选并经病理诊断证实。体外培养前列腺癌细胞PC3M由吉林大学基础医学院病理生理学教研室惠赠;NIH3T3细胞由吉林大学第三临床学院中心实验室惠赠。
1?2 免疫组织化学染色
免疫组织化学染色采用链霉素抗生物素蛋白?过氧化物酶连接法(SP法)。所用一抗(MMP7,9,13)、二抗、三抗及DAB均购自迈新公司。步骤如下:梯度脱水、脱蜡,过氧化物酶(A液)阻断15 min,非免疫动物血清(B液)封闭;加入一抗,4℃过夜后;加生物素标记二抗(C液)30 min,滴加链亲和素?过氧化物酶溶液(D液)30 min;DAB发色,水洗终止;苏木精复染细胞核,常规脱水透明,中性树胶封片。
1?3 形态定量方法
通过Cooled CCD采集预计数视野图片,而后采用Image?Pro Plus Analysis Software分析表达阳性的切片。
1?4 细胞培养
在含10%新生牛血清和抗生素的IMDM培养液中培养人前列腺癌细胞PC3M。
1?5 Boyden小室肿瘤侵袭试验
NIH3T3条件培养液的制备:铺Matrigel基膜胶,收集前列腺癌细胞,向小室上室内加入100 μl癌细胞悬液,于37℃,5%CO2条件下孵育4~6 h,醋酸?酒精?甲醛固定液固定20 min,HE染色,中性树胶封片。侵袭细胞的计数:在400×视野下任取10个不重复视野,利用目镜测微尺计数每个视野穿透Matrigel基膜胶下室面的肿瘤细胞数目,计算平均值。
1?6 酶谱分析
酶谱分析基本步骤:配制含1 mg/ml明胶的10%SDS?PAGE底物;将已制好的浓缩蛋白样品不经加热直接上样;以5 mA/gel电泳,当样品进入分离胶后,将电泳电流提高到10 mA/gel;电泳完成后,将底物胶置于孵育缓冲液中37℃缓慢摇摆18 h,以使待测MMPs充分作用于底物;孵育结束后经考马斯亮蓝染色30 min及脱色液(45%甲醇,10%冰乙酸)脱色60 min,观察结果。利用图像分析软件对酶谱分析结果进行灰度扫描。利用紫外分光光度法测蛋白质含量,每组细胞设3个平行样本,组织酶谱分析重复多次观察。具体步骤:电泳、封胶后,利用图像分析程序,读取图像反转膜式后各消化条带的灰色度及面积,计算各条带的酶含量。酶含量=条带面积×(条带灰度减于背景灰度),将所得值再换算成单位蛋白表达量作为最终测得的酶含量值,从而对各组细胞的酶活性进行定量比较。
1?7 统计学处理
所有统计均由INSTAT统计软件包完成。两组间均数采用t检验。
2 结果
2?1前列腺癌中MMP7和MMP9的表达
5例正常前列腺组织中,MMP7和MMP9均为3例阳性表达和2例阴性表达。前列腺癌中MMP7和MMP9均阳性表达,其蛋白均主要表达于肿瘤细胞胞浆或胞膜中,部分间质细胞和血管内皮细胞也呈阳性表达(图1),MMP7灰度值为32 047 930±9 499 987,MMP9灰度值为23 873 011±14 414 601。前列腺癌各分级中MMP7和MMP9的表达均有显著性差异(P<0?001)(图1)。<>
2?2 Boyden小室侵袭实验
在Boyden小室的上室内分别加入前列腺癌细胞PC3M,PC3M+MMP9Ab (1∶100),PC3M+MMP9Ab (1∶50),结果显示,穿透Matrigel的细胞数依次递减,即PC3M> PC3M+MMP9Ab (1∶100)> PC3M+MMP9Ab (1∶50),均有显著学差异(P<0?01)(图2)。<>
2?3 酶谱分析结果
见图3。酶谱分析观察发现,直接培养于培养皿表面的PC3M 细胞仅有稳定的MMP9(92 kD)(12 064±874), MMP2(72 kD)酶原表达,但PC3M细胞与VEGF共孵育组,条件培养基中MMP9酶原含量以VEGF剂量依赖的方式增加〔30 ng/ml:51 075?8±1 128,10 ng/ml(254 352±1 019)〕(P<0?001,表1)。<>
3 讨 论
3?1 MMPs与前列腺癌侵袭、转移的关系
ECM是癌细胞侵袭和转移的主要防御屏障,癌细胞从病灶原位向周围组织间隙侵袭必须首先突破ECM,因此ECM与癌组织的生物学行为及预后密切相关〔5〕。MMPs主要通过降解ECM、释放和/或活化生长因子、参与肿瘤血管的生成等,从而在肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用〔6〕。在MMPs家族中MMP9属于明胶酶类,也称Ⅳ型胶原酶(collagenase),因其参与ECM的主要成分Ⅳ型胶原的降解,在肿瘤的血管新生、肿瘤细胞的侵袭和转移灶的形成等过程中扮演着重要的角色〔7〕。研究证实,在许多上皮源性恶性肿瘤中,发现有MMP?9的表达和(或)活性增强〔8〕, Davies等〔9〕在膀胱肿瘤组织中也检测到了MMP?9,且明显高于正常对照组,但目前关于MMP?9在前列腺癌中的表达情况鲜有报道。MMP7亦称基质溶素,属于间质溶素类,其主要作用底物为层黏连蛋白(LN)、纤维蛋白、蛋白多糖和核心蛋白。而LN亦为ECM的主要成分。既往研究已发现,LN作为构成细胞外基质主体结构的糖蛋白,首先介导了肿瘤细胞对基底膜的附着,然后在瘤细胞分泌的蛋白溶酶作用下发生分解,形成一个解剖上的植入点,使肿瘤细胞得已突破基质膜发生侵袭和转移〔10〕。本研究显示,正常前列腺组织中MMP7和MMP9不表达或微量;前列腺癌中MMP7和MMP9的蛋白均主要表达于肿瘤细胞胞浆或胞膜中,部分间质细胞和血管内皮细胞也呈阳性表达,且MMP7和MMP9的表达随着前列腺癌分级的增高而增强,各组间均有显著性差异(P<0?001)。在boyden小室侵袭实验中,我们在上室内分别加入前列腺癌细胞pc3m,pc3m+mmp9ab (1∶100),pc3m+mmp9ab (1∶50),结果显示,穿透matrigel的细胞数依次递减,即pc3m> PC3M+MMP9Ab (1∶100)> PC3M+MMP9Ab (1∶50),表明当MMP9被其抗体中和而数量减少时,其侵袭作用减弱,也因此说明MMP9在肿瘤侵袭中具有重要作用。我们认为MMP7和MMP9确可降解基膜,且随着肿瘤恶性程度的提高,此种降解作用逐步增强,肿瘤侵袭和转移的能力必将增强。MMP7和MMP9可作为肿瘤侵袭和转移的判定指标。<0?001)。在boyden小室侵袭实验中,我们在上室内分别加入前列腺癌细胞pc3m,pc3m+mmp9ab (1∶100),pc3m+mmp9ab (1∶50),结果显示,穿透matrigel的细胞数依次递减,即pc3m>
3?2 VEGF对前列腺癌细胞表达MMPs的作用及意义
近年来,研究人员已逐渐开始关注VEGF和MMPs的关系。有报道发现VEGF可显著刺激血管壁平滑肌细胞产生并分泌MMP?9与MMP?1,其信号转导途径依赖于VEGFR?1〔11〕。在乳腺癌细胞的明胶酶谱分析实验和免疫印迹实验中,也发现PC细胞分化生长因子(PCDGF/GP88)可刺激VEGF的释放,并上调MMP9,由此认为MMP9和VEGF间存在一定联系〔12〕。还有文献报道,在肾细胞癌中,MMP9和VEGF的表达呈正相关,MMP9和VEGF的协同作用影响肾细胞癌的血管生成〔13〕。因此,可以认为VEGF和MMPs可能存在某种相互作用。为明确VEGF对MMPs产生、分泌与活化的影响,我们利用酶谱分析的方法设计了一组癌细胞条件培养基的对照实验。发现直接培养于培养皿表面的PC3M细胞有稳定的MMP?9和MMP?2酶原表达,而PC3M细胞与VEGF共孵育组,条件培养基中MMP?9酶原含量以VEGF剂量依赖的方式增加,结果证实VEGF确与MMPs的分泌有关,VEGF可刺激MMPs的分泌、表达,因而在肿瘤的侵袭中扮演重要角色,其作用机制还有待于进一步探讨。本研究通过MMPs和VEGF在前列腺癌中的表达情况,探讨二者在前列腺癌侵袭和转移过程中的作用及意义。为临床寻求有效治疗前列腺癌的新方法,预防和减少前列腺癌的侵袭和转移、提高治愈率提供了可靠的理论基础。
酶谱分析观察发现,直接培养于培养皿表面的pc3m 细胞仅有稳定的mmp?9和mmp?2酶原表达,但pc3m细胞与vegf共孵育组条件培养基中mmp?9酶原含量以vegf剂量依赖的方式增加。结论 mmp7和mmp9可作为肿瘤侵袭和转移的判定指标。vegf与mmps的分泌有关,其机制有待于进一步探讨。<><0?001)。boyden小室侵袭实验显示,不同试验组穿透matrigel的细胞数依次递减,即pc3m>